PVX病毒载体介导2种马铃薯Y病毒科病毒VPg蛋白表达诱导烟草叶片系统坏死的研究

芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus, TuMV）和槟榔坏死环斑病毒（Areca plam necrotic ringspot virus, ANRSV）是马铃薯Y病毒科（Potyviridae）中分别可诱导十字花科作物和槟榔产生坏死病症的2种不同属病毒。VPg（Viral protein genome linked）作为与马铃薯Y病毒科病毒基因组5′端的结合蛋白,在病毒复制、翻译和运动等侵染过程中发挥重要作用。本研究利用In-Fusion克隆策略分别构建了可表达3′端融合Strep蛋白标签序列的ANRSV和TuMV VPg全长编码基因的马铃薯X病毒（Potato virus X, PVX）载体pPVX-VPg-AR和pPVX-VPg-Tu。通过农杆菌渗透注射接种本生烟（Nicotiana benthamiana）,利用RT-PCR、Strep蛋白标签亲和层析和Western blot等方法证明了PVX病毒载体能够介导VPg-AR和VPg-Tu蛋白在本生烟中系统表达,且发现这2种VPg蛋白的过量表达诱导本生烟叶片产生了不同程度的系统性坏死病症。进一步采用DAB和NBT染色,在产生坏死症状叶片中检测到大量活性氧（reactive oxygen species, ROS）的积累。因此,推测VPg可能是TuMV和ANRSV诱发植物病症产生的一个决定因子,为后续研究这2种病毒诱导症状形成机制奠定了基础。     

转基因甘蔗BtG-2的T-DNA侧翼序列分析及其转化事件特异性检测

转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。     

苗期甘蔗氮高效基因型评价指标的筛选

本研究通过低氮压力选择,筛选出甘蔗氮高效种质,分析影响甘蔗氮高效的重要指标,为甘蔗氮高效育种及栽培提供理论依据。以58份甘蔗种质资源为材料,在苗期采用正常供氮（2 mmol/L N）和低氮（0.2 mmol/L N）处理,分析甘蔗植株形态、干重及氮素在各器官中累积分配的特征。通过主成分分析方法筛选影响甘蔗氮高效利用的重要指标,通过聚类分析对58份种质进行聚类。结果表明,低氮（0.2 mmol/L N）处理可以明显从植物形态区分不同种质的氮利用差异,58份种质低氮条件下的干重范围为0.64~14.75 g/株,氮累积量为5.53~63.00 mg/株,氮利用率范围为115.40~279.30 g/g。对低氮压力下甘蔗干重及氮累积等25个指标进行主成分分析后,提取出4个主要成分,总贡献率为92.35%。通过高、低氮条件下与氮利用效率有关的氮转移系数及基因潜力等19个指标分析后提取出5个主成分,总贡献率为82.21%。影响甘蔗氮高效的重要指标有甘蔗的干重（全株、叶、根）、氮累积量（全株、叶、茎）、氮利用率（全株、叶）、叶的相对氮利用率、茎的基因潜力、茎的相对干物质量和茎的相对氮累积量。经聚类分析后初步将58份甘蔗种质分为氮高效基因型、偏氮高效基因型、偏氮低效基因型和氮低效基因型。     

基于GSS序列的猴面花miRNA生物信息学研究

应用miRtour在线分析工具对猴面花GSS序列进行分析,预测猴面花的miRNA序列,应用psrobot预测miRNA的靶基因。结果发现50条不同的猴面花miRNA成熟序列,尿嘧啶在miRNA 5′端第1碱基出现频率最高,有64条编码序列受到猴面花miRNA的调控。靶基因中有15个编码转录因子,有21个编码酶。     

香蕉MYB基因克隆和表达分析

【目的】获得香蕉抗逆相关转录因子。【方法】通过随机克隆测序的方法从香蕉根系c DNA文库中获得MYB基因,命名为Ma MYB1。【结果】对扩增获得的c DNA序列进行生物信息学分析,表明Ma MYB1是香蕉MYB基因编码框全长c DNA,包含一个951 bp的最大开放阅读框,编码一个长316个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列同源比对发现其含有完整的2个保守的MYB结构域R2和R3,属于典型的R2R3-MYB基因。系统进化树比对分析表明,Ma MYB1与海枣(XP_008808341.1)和油棕(XP_010914123.1)的亲缘关系较近。组织特异性研究表明该基因在叶、根和花中的表达量较高。实时荧光定量PCR分析表明Ma MYB1响应干旱、低温、盐和枯萎病菌的侵染等胁迫处理。【结论】Ma MYB1基因在香蕉响应逆境中扮演重要的调控角色。     

5个香蕉品种的假茎对香蕉象甲的诱捕效果比较

【目的】明确5个香蕉品种假茎对2种香蕉象甲的诱捕效果,为利用香蕉假茎防治香蕉象甲这一农业防治措施提供理论依据。【方法】利用香蕉假茎田间诱捕及2种香蕉象甲对香蕉假茎的室内选择反应分析5个香蕉品种假茎的诱捕效果。【结果】田间诱捕试验结果表明,5个香蕉品种假茎对2种香蕉象甲均有有效的诱捕作用,每个诱捕器10 d诱捕量为9.0~18.0,而且‘巴西蕉’和‘宝岛蕉’的诱捕效果显著优于‘海贡蕉’‘广粉1号’粉蕉和‘广东香蕉1号’的诱捕效果;室内选择反应试验结果表明,5个香蕉品种假茎对2种香蕉象甲的诱捕效果高低顺序依次为‘巴西蕉’,‘宝岛蕉’,‘海贡蕉’,‘广粉1号’粉蕉和‘广东香蕉1号’。【结论】5个香蕉品种假茎均可用于防治2种香蕉象甲,但应首选‘巴西蕉’和‘宝岛蕉’。     

根结线虫拮抗放线菌的筛选及菌株HA10002的鉴定与活性物质分析

为了筛选获得对根结线虫具有拮抗能力的强活性放线菌菌株,并从菌株中发现新的杀线虫活性化合物,从海南东寨港红树林采集海泥样品9份,从五指山原始森林等地采集土壤样品51份,用平板稀释法对海泥和土壤样品进行分离;以南方根结线虫2龄幼虫为靶标线虫,采用24孔细胞培养板液体线虫法进行初筛和复筛;根据形态特征、培养特征、生理生化特征和16S rDNA序列对复筛出的活性菌株进行鉴定;菌株发酵液经溶媒萃取、硅胶柱层析、Sephadex LH 20凝胶过滤和制备薄层板层析,采用活性跟踪法从中分离纯化杀线虫活性化合物;化合物经光谱及波谱分析和文献对照,进行结构鉴定。从60份样品中分离得到356株菌落形态有差异的放线菌。初筛得到16株对根结线虫校正死亡率在80%以上的菌株,复筛获得3株线虫校正死亡率在95%以上的菌株,其中分离自海泥样品中的菌株HA10002抗线虫活性最强,发酵原液的校正死亡率达100%。HA10002经鉴定为白浅灰链霉菌,从其发酵液中分离获得2个活性化合物,其中A26 3为Nocardamine,A22 1的结构正在进一步鉴定中。上述结果表明,筛选出的放线菌HA10002能合成2种以上杀根结线虫的活性代谢产物,是一株遗传稳定且具有开发潜力的活性菌株。     

CRISPR/Cas9系统在植物育种中的应用

人工核酸酶系统是在特定的基因组位点,进行切割进而利用生物内源的修复系统对目标基因进行编辑,创造新基因型的基因编辑技术。CRISPR/Cas9系统是原核生物抵御噬菌体侵染的天然适应性免疫系统。经过优化的CRISPR/Cas9编辑系统凭借操作简单,突变效率高,成本低等特点优越于其他核酸酶系统,比如锌指核酸酶系统和TALE核酸酶系统。目前,优化改造后的CRISPR/Cas9编辑系统已经在植物功能基因研究和新材料创制中得到了广泛地应用。本研究简述了CRISPR/Cas9编辑系统的结构和作用机理,归纳并论述了CRISPR/Cas9系统在植物中的编辑效率与脱靶效应和在改良作物农艺性状中的应用。最后,总结了CRISPR/Cas9系统在功能基因组学研究中应用扩展,以及展望了该系统在作物育种中的发展前景及应用价值,期望为高效利用CRISPR/Cas9系统进行新材料创制、作物品种改良提供参考。      

二倍体西瓜及其同源四倍体叶片sRNA表达谱分析

植物多倍化后的基因表达平衡重建受到sRNA调节,miRNA是植物多倍化中基因表达进行反式调控的主要小分子成员。本研究利用新一代高通量测序对西瓜二倍体(2n)及其同源四倍体(4n)叶片的sRNA进行表达谱测序分析。结果表明:(1)2n中sRNA以21 nt为主,4n中则以24 nt为主。(2)在2n和4n鉴定出已知miRNA分别为110个和172个,新miRNA分别为246和829个,其中差异表达的已知miRNA 205个,新miRNA 815个。(3)GO功能显著性富集分析表明差异表达的miRNA在细胞组成、代谢过程及催化活性上显著富集。(4)KEGG代谢分析表明,差异表达的已知miRNA主要富集在初级代谢和次级代谢途径上,新miRNA则主要富集在植物激素信号转导途径、RNA转运途径和ABC转座子途径上。(5)差异表达的miRNA中与植物抗逆胁迫相关的已知miRNA 25个,新miRNA 62个,且80.46%抗逆miRNA在西瓜二倍体中上调表达,是四倍体中的4倍以上。根据miRNA的负向调控原理推测这些上调表达的miRNA在西瓜二倍体中可能会抑制部分抗逆基因的表达,影响二倍体的抗逆性。本研究在转录后调控调控水平上为西瓜多倍体较二倍体拥有更强抗逆性提供了理论依据,同时对西瓜多倍体及二倍体之间的基因表达谱分析做了补充。     

黄皮白肉火龙果快繁体系的建立

黄皮白肉火龙果,又名麒麟果,为建立其快繁体系,本研究选取种子萌发长出的茎段为外植体,研究其不同消毒时间、不同浓度激素配比对其愈伤组织及芽的诱导、增殖继代、根生长的影响。结果表明:用无水乙醇灭菌40 s后,再用5%次氯酸钠溶液灭菌10 min,种子萌发率最高可达97%。愈伤组织及不定芽诱导培养基最佳配方为1/2 MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA,芽的诱导率最高可达97%;利用MS+2.0 mg/L 6-BA+3.0 mg/L NAA培养基进行增殖、继代培养的效果最佳,增值系数最高为4.6;在MS培养基中添加2.0 mg/L IBA,可最大程度地促进根的生长。